摘要
探讨接受体外受精助孕的多囊卵巢综合征（ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃｏｖａｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ，PCOS）女性患者的卵泡液同型半胱氨酸（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ，Ｈｃｙ）浓度与卵子及胚胎质量的关系。方法收集７７对准备行IVF助孕夫妇的女性患者的取卵日卵泡液及月经周期第３天的血液标本。其中４５例患者为ＰＣＯＳ，３２例患者为输卵管因素，并且男方精液检测均在正常范围。采用酶联免疫吸附试验（ELSA）测定血清与卵泡液中Ｈｃｙ的浓度；分析卵泡液、血清Ｈｃｙ浓度与卵母细胞及胚胎参数之间的关系。结果PCOS组患者血清及卵泡液Ｈｃｙ浓度显著高于输卵管因素组；PCOS组患者ＭⅡ卵率、正常受精率及优质胚胎率均显著低于输卵管因素组；在PCOS组，按照卵泡液Ｈｃｙ浓度不同将患者分成三组，MII卵和MI卵之间卵泡液Ｈｃｙ浓度存在显著差异（Ｐ＜０．００１），不同组间正常受精率存在显著差异（Ｐ＜０．００１），１级和２级胚胎的卵泡液Ｈｃｙ浓度显著低于３级胚胎（Ｐ＜０．００１）。结论卵泡液Ｈｃｙ浓度可能对准备接受IVF助孕的PCOS女性的卵子成熟度、正常受精率及胚胎质量有一定影响。
关键词卵泡液；多囊卵巢综合征；同型半胱氨酸；体外受精
多囊卵巢综合征（ＰＣＯＳ）是育龄女性常见的内分泌及代谢异常疾病，其患者在体外受精（ＩＶＦ）诊疗过程中虽有较高的获卵率，但累计妊娠率不高。
同型半胱氨酸（Ｈｃｙ）是人体内蛋氨酸和半胱氨酸代谢的重要中间产物，在很多研究中，ＰＣＯＳ患者的血清Ｈｃｙ浓度都表现出升高趋势［１－３］。而且一些研究发现Ｈｃｙ的浓度升高，生育力会受到一定程度的影响［４－５］，胚胎质量评分较低，并且增加出生缺陷的风险［６－７］。本研究旨在探讨ＰＣＯＳ患者ＩＶＦ过程中Ｈｃｙ对卵子质量和妊娠结局的影响。
1.资料和方法
１．１一般资料
２０１５年１０月—２０１６年５月在我院准备接受体外受精－胚胎移植（ＩＶＦ－ＥＴ）助孕（第１周期）的４５对夫妇为女方患有ＰＣＯＳ、男方精液正常，３２对夫妇为女方输卵管因素、男方精液正常，纳入本次研究。ＰＣＯＳ患者的诊断标准采用２００３年鹿特丹标准；同时，收集以上患者月经周期第３天的血清及取卵日当天的卵泡液。所有患者均接受标准的长方案治疗。根据Ｉｓｔａｎｂｕｌ共识对卵母细胞成熟度以及卵裂期胚胎质量进行分级。
１．２方法
１．２．１ＩＶＦ基本流程和标本制备月经第２１天（Ｐ－ＣＯＳ患者长期未来月经，先用*体酮撤退出血，见血的第２１天），给予短效ＧｎＲＨ－ａ（天兴，成都天山台制药有限公司）降调节，根据患者监测指标给予Ｇｎ（丽申宝，丽珠集团丽珠制药厂）启动量，当至少有３个优势卵泡直接达２０ｍｍ，参考激素水平停用促排卵药和ＧｎＲＨａ，当晚肌注ｒ－ＨＣＧ（艾泽，雪兰诺欧洲公司）２５０μｇ，注射后３６ｈ，阴道超声下取卵。取卵过程中，取出直径大于１４ｍｍ的成熟卵泡，并将每位患者的第一管卵泡液单独收集待测，保证没有血液及其他污染。将卵泡液置于ＺＯＮＫＩＡＬＣ－１８０离心机，以２５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去除红细胞、白细胞及颗粒细胞等成分。分装标记后存放于－７０℃冰箱待统一测定。同日收集患者空腹静脉血清保存待测。取卵后７２ｈ进行胚胎移植。移植后１４ｄ测血ＨＣＧ，血ＨＣＧ＞１０ＩＵ／Ｌ，确定为着床成功；移植后２８ｄ或以后行超声检查确定是否临床妊娠。
１．２．２标本的检测Ｈｃｙ浓度的测定均使用北京百奥莱博酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）试剂盒，批内误差＜９％，批间误差小于１５％；抗缪勒氏管激素（ＡＭＨ）测定采用广州市康润生物科技有限公司的ＥＬＩＳＡ试剂盒，批内误差＜１０％，批间误差＜１５％；促卵泡生成素（ＦＳＨ）测定使用西门子公司的化学发光法试剂盒，批内误差＜１０％，批间误差＜１５％。
１．２．３统计学分析采用ＳＰＳＳ１５．０软件进行数据处理。分别对相应数据进行卡方检验、ｔ检验、非参数检验。检验水准α＝０．０５。
2.结果
２．１二组患者基本情况比较
在接受ＩＶＦ助孕的７７对夫妇中，按女方因素分组的二组患者的基本情况的比较见表１，二组患者卵子质量及胚胎参数的比较见表２。ＰＣＯＳ组患者的平均体质指数显著高于输卵管因素组患者的体质指数（Ｐ＜０．０５），见表１；ＰＣＯＳ组患者的血清、卵泡液Ｈｃｙ浓度显著高于输卵管因素组患者的血清、卵泡液Ｈｃｙ浓度（Ｐ＜０．０１），见表２；同时，ＰＣＯＳ组和输卵管因素组的成熟卵（ＭⅡ卵）率存在显著差异（Ｐ＜０．０１），见表３、受精率和优胚率均存在差异（Ｐ＜０．０５），见表３。
２．２ＰＣＯＳ组患者根据卵泡液Ｈｃｙ浓度分组的基本情况的比较将ＰＣＯＳ组患者卵泡液Ｈｃｙ浓度按照百分位数分组，其中第２５％，５０％，７５％的百分位数卵泡液Ｈｃｙ浓度分别为６．８μｍｏｌ／Ｌ、７．９μｍｏｌ／Ｌ、８．９μｍｏｌ／Ｌ，＜６．８μｍｏｌ／Ｌ为低浓度组，≥６．８μｍｏｌ／Ｌ且＜８．９６μｍｏｌ／Ｌ为中浓度组，≥８．９μｍｏｌ／Ｌ的为高浓度组。高、中、低浓度组的平均年龄、ＢＭＩ、ＡＭＨ、ＦＳＨ、获卵数、ＭⅡ卵数和受精卵数均未见显著差异，见表４。
3.讨论
ＰＣＯＳ是育龄女性常见的内分泌异常疾病，患者达到全部育龄女性人群的５％～１０％［８］，其临床表现主要包括月经紊乱、高雄激素血症及卵巢多囊样改变，部分患者伴有血浆Ｈｃｙ水平增高［９－１０］。Ｐ－ＣＯＳ是无排卵性不孕的常见原因，患者促排卵治疗中妊娠率低、流产率高等问题在ＩＶＦ助孕中仍然存在。其获卵率虽然通常较高，但是累积妊娠率却明显低于非ＰＣＯＳ患者［８］，这可能与患者整体Ｈｃｙ水平和卵母细胞局部微环境中的Ｈｃｙ水平异常相关［１１］。Ｈｃｙ是含硫氨基酸蛋氨酸和半胱氨酸代谢的中间产物，其合成和分解保持平衡。关键酶的活性异常会导致Ｈｃｙ的代谢障碍，从而出现高Ｈｃｙ血症［１２］。近些年Ｈｃｙ代谢对生育力方面影响的研究逐渐引起广泛重视［７，１３］。
本研究纳入７７对接受ＩＶＦ助孕夫妇的女性患者，检测其月经周期第３天血清Ｈｃｙ与取卵日卵泡液中Ｈｃｙ的浓度，并分析其与卵子、胚胎等的相关参数的关系。研究发现，ＰＣＯＳ组患者血清及卵泡液Ｈｃｙ浓度显著高于对照组；ＰＣＯＳ组患者按照卵泡液Ｈｃｙ浓度不同将患者分组，ＭⅡ卵和ＭⅠ卵之间卵泡液Ｈｃｙ浓度存在显著差异（Ｐ＜０．０５），１级和２级胚胎的卵泡液Ｈｃｙ浓度显著低于３级胚胎。因此推断Ｈｃｙ对女性生育力可能存在一定的影响。
本研究发现，ＰＣＯＳ组患者血清及卵泡液Ｈｃｙ浓度显著高于输卵管因素组。正常人体内Ｈｃｙ的代谢保持动态平衡，涉及多个酶和中间产物，因此引起Ｈｃｙ水平异常的原因是多方面的。Ｐａｌｅｐ－Ｓｉｎｇｈ等［１４－１５］发现ＰＣＯＳ患者体内存在ＭＴＨＦＲ６６７的ＴＴ基因型并与体内Ｈｃｙ水平的升高相关，发现ＭＴＲ２７５６的ＡＡ基因型与ＰＣＯＳ女性Ｈｃｙ水平的升高密切相关。ＰＣＯＳ的重要病理生理特征为高雄激素血症、高胰岛素血症和／或胰岛素抵抗（ＩＲ）。目前普遍接受在心血管疾病的发病中，胰岛素抵抗导致高同型半胱氨酸血症。Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ等［２］认为ＰＣＯＳ患者胰岛素抵抗造成的高胰岛素血症可能抑制肝脏合成胱硫醚β合成酶，进而导致Ｈｃｙ代谢障碍。总之，虽然ＰＣＯＳ患者体内Ｈｃｙ升高的原因尚未完全明确，但是ＰＣＯＳ患者体内Ｈｃｙ升高的现象已经逐渐被认可并引起重视。Ｈｃｙ可以通过主动运输通过细胞膜，因此作为卵子所处微环境的卵泡液，其Ｈｃｙ浓度与血清中Ｈｃｙ浓度密切相关。
本次研究中发现，ＭⅡ卵和ＭⅠ卵之间卵泡液Ｈｃｙ浓度存在显著差异（Ｐ＜０．０１）。同时，Ｈｃｙ高浓度和低浓度的卵泡液的卵子受精率存在显著差异（Ｐ＜０．０１），说明卵泡液Ｈｃｙ浓度在卵子发育和受精过程中发挥重要作用。同时，在接受ＩＶＦ助孕的ＰＣＯＳ患者其卵泡液Ｈｃｙ水平反应了患者卵子受精的潜能。这可能是由于卵泡局部微环境中高浓度Ｈｃｙ的直接细胞*性：内膜的损伤，氧化应激物质（ＲＯＳ）的过度产生，转甲基作用受到抑制，基因的异常表达［１６］和间接*性：活性氧（ＲＯＳ）的过氧化作用导致卵母细胞质量和发育潜能受损伤［１１］。卵泡液作为卵子生长发育的微环境，卵泡液中包括很多物质、酶和激素来保证卵子正常代谢和功能，某些物质浓度过低或过高都会对卵子发育产生一定的影响［１７］。因此，我们可以推断出卵泡液高浓度的Ｈｃｙ可能导致许多卵子发育缺陷，可能阻碍受精或影响助孕的结局。
本研究发现不同Ｈｃｙ水平组的胚胎质量差异显著。其中，３级胚胎的卵泡液Ｈｃｙ浓度显著高于１～２级胚胎的卵泡液Ｈｃｙ的浓度，说明在接受ＩＶＦ助孕ＰＣＯＳ患者，卵泡液Ｈｃｙ浓度与胚胎质量存在直接关系。我们的发现与Ｅｂｉｓｈ［１８］和Ｂｅｒｋｅｒ［１９］的研究报道一致。ＰＣＯＳ患者高浓度的Ｈｃｙ一方面抑制甲基化和ＲＮＡ、ＤＮＡ合成而对胚胎有直接*性作用，另一方面使胎盘血管化不良，从而降低胚胎着床率，升高流产率［２０］。
本研究还存在一些局限性问题。首先，本次研究纳入的病例数比较少，容易使结果产生偏倚。其次，由于卵泡液中蛋白质的含量比较高，从而增加了标本的检测难度；同时卵泡液中容易混入血液，引起误差的概率比较大。本研究认为，接受ＩＶＦ助孕的ＰＣＯＳ患者卵泡液Ｈｃｙ浓度的增高可能会影响卵子及胚胎质量。然而，Ｂｏｘｍｅｅｒ在接受ＩＶＦ助孕患者的两次研究中却得出了相反的结论［５，２１］。Ｂｏｘｍｅｅｒ［５］认为，由于两次研究测定的Ｈｃｙ浓度水平接近，可能是样本量较小导致。Ｈｃｙ作为一种硫醇诱导释放的ＲＯＳ对卵子成熟和受精过程非常重要，即卵泡液中某个生理剂量的ＲＯＳ对卵泡成熟［２２］和排卵［２３］是必须的。而且，先前的一些研究显示经过ＩＶＦ助孕成功的女性卵泡液ＲＯＳ显著高于未成功的女性。因此，卵泡液Hcy的浓度可能反映出卵子所处的微环境，进一步可以推断卵泡液Hcy有可能是在某范围浓度都有可能对卵子质量乃至妊娠结局产生不利的影响。因此，未来的研究应该探索适宜的卵泡液Hcy的浓度范围区间，以利于判断ivf的妊娠结局。在未来的研究中，不近应该更加注重机制的研究，进一步明确Hcy对女性生育力的影响。
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作者：安萍韩宝生樊桂玲赵铭佳罗萌萌
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来源：知网
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